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ELISPOT para la detección de citocinas y ensayo FluoroSpot

Sefina Arif, King’s College, Londres, Reino Unido
Traducción: Jesús Gil, Instituto de Biología Molecular, Mainz, Alemania

El ELISPOT para la detección de citocinas es una técnica, tanto cuantitativa como cualitativa, basada en la inmunoabsorción ligada a enzima (ELISA) y diseñada para contar células secretoras de citocinas. Se trata de una técnica extremadamente sensible, por lo que es muy útil para detectar células secretoras que se encuentren en pequeñas cantidades (1/300.000). Las citocinas liberadas en respuesta a un antígeno pueden mapearse a nivel de una única célula, por lo que es posible calcular la frecuencia de células T respondedoras. Las células pueden estimularse a través de placas recubiertas con anticuerpos anti-citocinas (ensayo directo) o bien ser preestimuladas y después transferidas a una placa previamente recubierta (ensayo indirecto) (Figura 1). Una vez que el ensayo está listo, las placas pueden analizarse en un lector de placas.

Recientemente el ensayo ha evolucionado a otro conocido como FluoroSpot, basado en el uso de anticuerpos de detección conjugados con fluorocromos que permite la detección simultánea de distintas citocinas y el siguiente análisis de subpoblaciones de células T (Figura 2).

La principal aplicación del ensayo ELISPOT/FluoroSpot es la monitorización de las respuestas inmunitarias tanto en humanos como en animales; actualmente se está usando una versión modificada como técnica diagnóstica en tuberculosis.

Figura 1. Resumen del ensayo ELISPOT. Las células se estimulan con un antígeno o un mitógeno durante 24-48 horas y después se transfieren a pocillos de placas previamente recubiertas con un anticuerpo anti-citocina durante 18-22 horas. Después se añade un anticuerpo anti-citocina biotilinado seguido de un anticuerpo anti-biotina marcado con φ. Posteriormente se añaden los reactivos, que permitirán la visualización de los puntos.

 

 

Aplicación de ELISPOT para la detección de citocinas

La técnica ELISPOT ha sido ampliamente usada en distintas disciplinas de la inmunología, cómo el trasplante de órgano sólido, cáncer, enfermedades infecciosas, desarrollo de vacunas y enfermedades autoinmunes, ya que su sensibilidad ha demostrado ser muy útil en la detección de células autorreactivas que aparecen en frecuencias muy bajas (Figura 3). Tanto el ensayo ELISPOT como el de FluoroSpot son muy usados en la monitorización inmunitaria en ensayos clínicos, donde la información cuantitativa y la identificación del fenotipo de células T a nivel de célula única proporciona una gran información.

Figura 2. Resumen del ensayo FluoroSpot. Se estimulan las células con antígeno o mitógeno durante 24-48 horas y después se transfieren a pocillos de placas previamente recubiertas con un anticuerpo anti-citocinas durante 18-22 horas. Los anticuerpos de detección anti-citocinas se añaden, seguidos de un conjugado marcado de forma fluorescente. Posteriormente se añade un reactivo que permitirá visualizar los puntos.

 


Figura 3. Ensayos de ELISPOT y FluoroSpot en diabetes de tipo 1. Células mononucleares de sangre periférica de pacientes con diabetes tipo 1 fueron estimuladas con un péptido del autoantígeno proinsulina, y se midió la respuesta de citocinas; respuestas de interferón-g (A) mostradas por ELISPOT y (B) FluorosSpot, que muestra respuestas tanto de interferón-g (verde) como de IL-10 (rojo). Las células que producen ambas se muestran en amarillo.

 

La versión en español ha sido coordinada por Jesús Gil-Pulido, responsable de redes sociales de la Sociedad Española de Inmunología, y ha sido posible gracias a miembros de la Sociedad Española de Inmunología (https://www.inmunologia.org/index.php)

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Técnicas experimentales